本文参照GB/T 17819-1999标准采用了501系列高效液相色谱法测定维生素预混料中维生素B12的方法。501高效液相色谱仪适用于维生素预混料、维生素B12预混制剂中维生素B12的测定。检测范围为每千克样品中维生素B12含量大于0.25mg,
2 方法原理
试样中维生素B12用水提取，经高效液相色谱反相柱分离，其峰面积与维生素B12的含量成正比
3 试剂和材料
本标准所用试剂除特殊注明外，均为优级纯，水为去离子水。
3.1 乙睛:色谱纯。
3.2 正磷酸溶液
3.3 25%乙醇溶液
3.4 维生素B12标准溶液。
3.4.1 维生素B12标准贮备溶液:准确称取0.1000g维生素B12纯品(符合USP),溶解于100Ml乙醇溶液(3.3)中，并稀释定容至刻度，摇匀。该标准贮备液每毫升含维生素B12 1mg.
3.4.2 维生素B12标准工作液:准确吸取维生素B12标准贮备液(3.4.1)1mL于50Ml容量瓶中，用移动相稀释定容刻度，摇匀。该标准工作液1Ml含维生素B12 2ug
4 仪器、设备
4.1 实验室常用设备。
4.2 超声波水浴。
4.3 STI501高效液相色谱仪；(配UV501紫外检测器）Vertex 色谱柱：150mm×4.6mm×5μm ；分析天平，0.00001g；
4.4 超纯水装置
4.5 离心机:3000r/min.
5 试样制备
取具有代表性样品至少500g，用四分法缩分至100g， 粉碎，全部过0.28mm 孔筛混匀，装入样品瓶内密闭，避光低温保存备用。
6 分析步骤
6.1 提取
6.1.1 维生素预混料中维生素B12的提取
称取试样 2-3g (精确至士0.0001g )，置于100mL棕色容量瓶中，加约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取15min，取出，用去离子水定容至刻度，混匀，过滤，滤液过0.45um滤膜，供高效液相色谱仪分析。
6.1.2 维生素B12制剂(1%-2%)的提取
称取试样1g(精确至±0.0001g)于100mL棕色容量瓶中，加人约60mL去离子水，在超声波水
浴中超声提取10min，取出用去离子水定容过滤。精确吸取1.00mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，该液通过0.45um滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析
6.2 测定步骤
6.2.1 色谱条件
柱子 :u-Bondpak NH2,粒度5um,3.9mm×300mm。Vertex NH2色谱柱，5um，4.6×250mm
柱温 :30℃。
流动相 : 3%正磷酸水溶液260mL与700mL乙膀混合，超声脱气。
流速 : 1.7mL/min,
检测波长 :361nm。
6.2.2 定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，用两次以上相应标准工作液，对系统进行校正。
将通过0.45um滤膜的样液(6.1.1)依次分装于自动进样小瓶中，依外标法上液相色谱仪测定
6.2.3 也可采用反相离子对高效液相色谱测定维生素B12的方法(见附录A)
7 测定结果的计算
测定结果按式(1)计算w1=Pi×V×pi×Vst/Pn×m×Vi
式中w1一每千克样品中维生素B12的含量，mg;
m- 试样质量，g;
Vi-试样溶液进样体积,uL;
Pi-试样溶液峰面积值;
V-试样稀释的体积，mL;
Pi-标准溶液浓度，ug/mL;
Vst-标准溶液进样体积,uL;
Pn-标准溶液峰面积平均值。
每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。结果表示到每千克样品中维生素B12 O.01mg
8 允许差
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差应不大于15%

反相离子对高效液相色谱测定预混料中维生案B12
A1 原理
试样中维生素B12经水提取后，注人反相色谱柱上，由于输入了有机的反相离子对四丁基磷酸铵(PIC A)和己烷磺酸钠(PIC-B6)溶掖，维生素B12的阳离子与移动相中阴离子形成离子偶化合物，在移动过程中与固定相分开达到分离.
A2 试剂和材料
1 甲醇(优级纯)。2 磷酸。
3 四丁基磷酸铵(PIC A),4 己烷磺酸钠(PIC-B6),
A3 测定色谱条件
柱子 :150 m×4.0mm(内径)不锈钢柱。VertexC18色谱柱，250mm×4.6，5um进口
固定相 :u-Bondpak C18(ODS)粒度5um,
移动相 :甲醇-水(250+750)约980mL，加入PICA/PICB6(各一小瓶)20mL，用上述25%甲醇水定
容至1L,混匀，用磷酸调节pH3,流速 :1ml/min,
柱温 :室温   检测器 :紫外检测器，使用波长365nm,
进样量 : 20uL,保留时间 :约7.0min